EFECTO DE LA MUTACIÓN DEL RECEPTOR A HORMONAS TIROIDEAS TIPO BETA SOBRE LA PREFERENCIA DE COLOR EN EL PEZ CEBRA

Abstract

Las hormonas tiroideas tienen un papel esencial dentro del grupo de los vertebrados. Por ejemplo, en anfibios participan de manera activa en el proceso de metamorfosis pues se eleva su expresión en ciertas ventanas de tiempo durante su desarrollo. Asimismo, participan en diversos procesos fisiológicos y pese a que se han encontrado en algunos invertebrados, estas actúan de manera particular en los vertebrados a través de factores de transcripción que se encuentran en el núcleo. Estos factores de transcripción llamados receptores a hormonas tiroideas, pertenecen a la familia de receptores nucleares (NRs) que se caracterizan por poseer un dominio de unión al DNA y un dominio de unión al ligando. En vertebrados, encontramos de manera general dos genes que codifican a los receptores a hormonas tiroideas denominados thra y thrb, cada uno codifica para diversas isoformas ya sea por splicing alternativo o a partir de un inicio diferente de la transcripción. También se ha descubierto que algunas de estas isoformas tienen una expresión y función en tejidos específicos y en algunos casos participan de manera más activa en una ventana de tiempo particular durante el desarrollo. Dentro de las isoformas específicas codificadas por el gen thrb se encuentra TRβ2 que se expresa en la retina del ojo. Se ha descubierto que esta isoforma participa en la formación de los conos de la retina, estas células participan en la foto-transducción en el proceso de la percepción visual. De manera particular, se ha demostrado que el receptor TRβ2 participa en la formación de los conos tipo L (longitudes de onda largas-rojo). Por lo anterior, con el fin de estudiar la fisiología del receptor TRβ2 en el desarrollo de la retina, se empleó al pez cebra (Danio rerio), modelo de estudio muy útil. Entre sus ventajas se encuentra, una fácil manipulación genética; por ejemplo, editar al receptor TRβ2 que también está presente en este modelo y ha sido denominado l-thrb+. Para explorar el efecto de la pérdida de función de la isoforma l-thrb+ sobre la fisiología de la foto-transducción del pez cebra, se utilizó la metodología de CRISPR/CAS9 para la edición del gen l-thrb+. Para ello se diseñaron dos sondas para mutar el gen, una que tiene como blanco específico la isoforma l-thrb+ (sg l-thrb+) y otra adicional, que, de manera ideal, muta todas las 8 isoformas codificadas por el gen thrb (sg thrb*). Se corroboró la mutación a través de la secuenciación en un grupo de diecisiete individuos, dos pertenecientes a animales silvestres (Wild Type, WT), otras ocho pertenecientes a los grupos inyectados con la gRNA (guía de RNA) l-thrb + y de manera adicional siete pertenecientes a la gRNA thrb*. Mediante el análisis de secuenciación observamos una eficiencia de mutación del 50% y el 71% de manera respectiva. Para evaluar si la mutación afecta la fisiología de la retina, los animales WT y los mutantes (crispantes) fueron evaluados mediante el empleo de la conducta de preferencia de color a los 5 días post fertilización (dpf). De manera independiente, se probó el efecto de la administración de hormonas tiroideas (HTs) en el medio de cultivo de animales WT y se sometieron a esta misma prueba. Como resultado se encontró que la preferencia hacia el color rojo disminuye en los crispantes thrb* (la que muta todas las isoformas). Por otra parte, las hormonas tiroideas T3 y T2 (0.1 nM y 1 nM) si mostraron un cambio en el patrón de conducta. Finalmente, se verificó a través de histología, que en los peces crispantes y los tratados con HTs no se altera la morfología general del ojo. Esto implica que el efecto observado en los experimentos no se debe a alteraciones generales del ojo, sino posiblemente a alteraciones específicas en los patrones de expresión de los conos de la retina.