Resumen:
Los osteoclastos (OST) son células multinucleadas móviles de gran tamaño cuya función es reabsorber hueso. Su diferenciación es un proceso complejo que involucra la fusión entre tres o más precursores mononucleados y la posterior fijación al hueso. Las rutas moleculares que inciden en la diferenciación de los OST se han estudiado desde que se encontró que en ratón el co-cultivo de células estromales con médula ósea o con células del bazo daban como resultado OST. Debido a su importancia en la homeóstasis del hueso, su estudio resulta fundamental para la comprensión de los mecanismos de enfermedades óseas, como la osteoporosis o la osteopetrosis, A pesar del impacto que tienen estas enfermedades en la calidad de vida, particularmente la osteoporosis; los estudios hechos en OST hasta ahora, sólo se han llevado a cabo mediante la obtención de OST in vitro lavados directamente del hueso, de precursores de médula ósea cultivados sobre cortes de hueso, y más recientemente adicionando CSF1 y RANKL; únicamente a precursores de sangre periférica de humano, y a precursores en médula ósea de ratón; sin considerar las ventajas intrínsecas de efectuar la diferenciación in vitro en otros modelos de estudio ni las desventajas de las técnicas existentes. Aunque el genoma del pollo se encuentra completamente secuenciado, hasta el momento la anotación continúa siendo pobre, por lo que los estudios genéticos y moleculares en el pollo donde se empleen técnicas que permitan analizar la expresión de varios genes simultáneamente, tales como los microarreglos, requerirán de una anotación apropiada para su análisis. Efectuar una buena anotación es importante porque permite determinar si en la secuencia que se analiza existe un gen conocido, identificar la conservación de genes y vías de señalización entre organismos; para así poder extrapolar los resultados obtenidos a otras especies.
El presente estudio tiene como objetivo diferenciar in vitro células precursoras monociticas de médula ósea en OST de pollo, así como realizar anotación funcional de varios genes expresados en OST; a fin de identificar genes específicos que pudieran en un futuro ser propuestos como blancos terapéuticos para enfermedades como la osteoporosis o la osteopetrosis. Para ello se optimizaron las condiciones requeridas para la producción de OST y MAC de pollo in vitro, posteriormente se realizó un microarreglo de ambos cultivos. Los datos devueltos por el microarreglo, se organizaron en función a los radios de expresión promedio entre ambos grupos. Se encontraron genes específicos de osteoclastos con homología en el pollo y otros organismos. Curiosamente, se encontraron marcos de lectura abierto enriquecidos en OST, sin embargo éstos presentan homología con los genomas de aves y no con los genomas del humano o del ratón.
Descripción:
El cultivo de células de MO de pollo durante tres días a 37 C con 5% de CO2 dio como resultado CPM, las cuales resentaron una apariencia más adherida a la superficie; además, este periodo de incubación permitió que las CPM proliferen y que fuera posible separarlas selectivamente de otras células presentes en la MO que no son capaces de diferenciarse en MAC o de fusionarse. Las CPM en medio enriquecido con 20% CSF1 dieron como resultado MAC a partir del cuarto día, mismas que tenían una apariencia similar a un “huevo frito”; en contraste, las CPM cultivadas en medio enriquecido con 5% RANKL dieron como resultado OST a partir del 4, y en el noveno día de la diferenciación se obtuvieron células de hasta 315 μm de diámetro.
En las células teñidas se lograron visualizar células multinucleadas que presentaban hasta veintiocho núcleos; aunado a esto, se observó que en ocasiones también los MAC se fusionaban resultando en células de hasta cuatro núcleos, por esta razón se realizó un gráfico de caja y bigotes que mostró que en cada cultivo las medias en el número de núcleos son diferentes, además de que mostró la diferencia en distribución percentil de dichos datos.