Inserción al azar de 6 aminoácidos en la región aminoterminal del dominio PDH para la estabilización de la proteína T de Escherichia coli

Abstract

La proteína T participa en la biosíntesis del aminoácido aromático tirosina a partir de corismato en la bacteria Escherichia coli; dicha proteína es codificada por el gen TryA, es homodímera y consta de 373 residuos de aminoácidos por monómero. Cada monómero tiene una masa molecular de 42 kDa. Esta enzima consta de dos dominios, el de corismato mutasa (CM) y el de prefenato deshidrogenasa (PDH). El dominio CM cataliza la conversión de corismato a prefenato por un rearreglo de Claisen, el segundo dominio, PDH, cataliza la conversión de prefenato a 4-hidroxifenilpiruvato, mediante una descarboxilación oxidativa utilizando NAD+ como cofactor, posteriormente por medio de una transaminación, catalizada por otro enzima, el 4-hidroxilfenilpiruvato se convierte en tirosina, que es un aminoácido aromático esencial para los organismos. Experimentos anteriores han demostrado que al expresar los dominios por separado, el dominio de CM presenta actividad enzimática y se expresa; no obstante, estos resultados no se observan en el dominio de PDH. Sin embargo, al sustituir el dominio de CM en la región amino terminal del dominio de PDH por dominios capaces de dimerizar se ha observado que hay expresión y actividad enzimática, lo cual indica que la dimerización ayuda a la estabilidad del dominio de PDH. En el presente proyecto se añadió una etiqueta de 6 aminoácidos al azar en la región amino terminal del dominio PDH, ya que se ha demostrado que la longitud de esta etiqueta es suficiente para observar actividad enzimática específica. Para esto se llevó a cabo el diseño de un oligonucleótido combinando las técnicas de evolución dirigida e ingeniería de proteínas (diseño racional) con el fin de generar diversidad a la secuencia de 6 aminoácidos. Posteriormente se construyó y se validó una librería de variantes. Utilizando esta librería se transformaron célula de E. coli de la cepa BW25113 carentes del gen tyrA, seleccionando aquellas que fueran capaces 8 de crecer en un medio mínimo, validando su genotipo y su fenotipo, se obtuvieron en total 8 variantes. Se realizó la caracterización de las 8 variantes las cuales mostraron un nivel de actividad enzimática y expresión de la proteína semejante a la observada por parte de la proteína T silvestre. Con dicho comportamiento podemos decir que una etiqueta de 6 aminoácidos es suficiente para que el dominio de PDH muestre expresión y actividad enzimática, y por tanto, capaz de transformar el prefenato en 4-hidroxilfenilpiruvato para la síntesis de tirosina.