Evaluación de la vacuna multicomponente TcVac1 contra la enfermedad de Chagas utilizando un protocolo de electroporación intradérmica

Abstract

Trypanosoma cruzi (T. cruzi), un protozoario hemoflagelado, es el agente etiológico de la enfermedad de Chagas. Ésta es la causa más común de muertes relacionadas insuficiencia cardiaca congestiva entre los adultos jóvenes en las áreas endémicas de Sudamérica, Centroamérica y México. También se ha convertido en un problema de salud importante en los Estados Unidos y Europa debido a la migración a gran escala de latinoamericanos en las últimas décadas. Los esfuerzos para el desarrollo de vacunas contra la infección por T. cruzi han aumentado en los últimos años. Nuestro grupo de trabajo ha diseñado una serie de vacunas (TcVac) compuestas por antígenos de membrana anclados a la GPI derivados de T. cruzi. Se ha demostrado que las vacunas TcVac aumentan las respuestas inmunitarias humorales y celulares y proporcionan un control significativo (pero no completo) de la infección experimental en ratones y perros. En el presente documento, nos propusimos probar dos protocolos de inmunización para la entrega de la vacuna de ADN (TcVac1) compuesta de antígenos TcG2 y TcG4 en un modelo de ratón BALB/c. En un primer ensayo se comparó la protección conferida por la vacuna TcVac1 administrada vía intramuscular (IM) contra el protocolo de vacunación electroporación/intradérmica (IDE). Se vacunaron cuatro veces, con quince días de diferencia a doce ratones BALB/c por grupo. Dos semanas después de la última inmunización, se sacrificó a la mitad de los animales (n=6) de cada tratamiento, para la evaluación de la eficacia de la vacuna en la pre-infección y la segunda mitad (n=6) se sacrificaron 60 días después de la infección con trypomastigotes cepa Sylvio X10/4 de T. cruzi, para ser evaluados durante la fase aguda de la infección. La respuesta inmune humoral se evaluó mediante la evaluación de los subtipos de IgG anti-TcG2 y anti-TcG4 utilizando un ensayo de ELISA. La respuesta inmunitaria celular se evaluó mediante un ensayo de proliferación de linfocitos. Por último, se evaluaron los aspectos clínicos y morfopatológicos para todos los animales experimentales. Nuestros resultados demostraron que al comparar la entrega IDE TcVac1 frente a la entrega IM, el primero indujo un nivel significativamente mayor de respuesta de anticuerpos específicos por III antígeno (IgG2a+IgG2b>IgG1) y proliferación de linfocitos, que se expandió en respuesta al desafío de infección. La evaluación histológica después de la infección por desafío mostró infiltración de células inflamatorias (macrófagos y linfocitos) en el corazón y el tejido esquelético de todos los ratones infectados. Sin embargo, el mayor aumento de infiltrados inflamatorios se observó en ratones TcVac1_IDE/Tc en comparación con TcVac1_IM/Tc o ratones no vacunados/infectados. La extensión del infiltrado inflamatorio tisular se asoció directamente con el control de los nidos de amastigotes intracelulares en ratones vacunados/infectados (contra a los no vacunados/infectados). Nuestros resultados sugieren que la administración de IDE mejora la eficacia protectora de la vacuna TcVac1 contra la infección por T. cruzi en ratones en comparación con la administración IM de la vacuna. Posteriormente en un segundo experimento, se probó la eficacia de diferentes dosis vacunales utilizando la modificación a la vacuna eliminando los plásmidos que codifican para la interleucina-12 y factor estimulante de colonias granulocitos-macrófagos (GM-CSF). En este ensayo, se probaron cinco dosis diferentes (1, 5, 10, 15 y 20ug) de la vacuna para determinar la dosis óptima recomendada para prevenir la infección por T. cruzi con aplicación intradérmica/electroporación de la vacuna. En este experimento se utilizaron cuarenta y dos ratones hembra, cepa CD1, subdivididos en 7 tratamientos diferentes (n=6/grupo). Después de la vacunación, los ratones fueron desafiados con cepa Ninoa/MHOM/MX/1994 de T. cruzi (500 trypomastigotes/ratón, intraperitonealmente). Se analizaron parámetros tales como parasitemia, prueba de supervivencia, prueba serológica (ELISA) y análisis histopatológicos para evaluar la eficacia de la protección de la vacuna y determinar la dosis óptima. Los resultados demostraron que el grupo vacunado con 10 μg de dosis de ADN plasmídico indujeron los mejores niveles de inmunoglobulinas específicos, la parasitemia más baja y el mayor control del nidos de parásitos en cardiomiocitos y tejido muscular esquelético. Se confirmó que la aplicación intradérmica en conjunto con la electroporación es un método eficaz para la administración de vacunas con ADN, ya que mejora la inmunogenicidad del plásmido entregado, y reduce el tiempo y el costo de preparación de la vacuna, se minimiza la dosis de la vacuna, el número de IV refuerzos de la vacuna se reduce a una sola aplicación y la vacuna no requiere el uso de adyuvantes. La patología es una disciplina que depende crucialmente de la interpretación de imágenes para el diagnóstico y pronóstico de enfermedades. Tradicionalmente las técnicas de interpretación se basaron en gran medida en el análisis subjetivo de los especímenes, con un acuerdo variable entre los observadores. La interpretación moderna hace uso tanto del análisis molecular, como de la cuantificación objetiva de a través de microscopía auxiliada por sistemas de digitalización óptica. La dificultad para que el sistema ocular/cerebro humano analice objetivamente un objeto dentro de una escena, independientemente de su información contextual (por ejemplo, la percepción de un objeto dado puede ser muy diferente según su contexto), lo que promueve la necesidad de un ayuda microscopía computarizada para su uso en la patología molecular. De ahí que nuestro tercer experimento se enfocó en el desarrollo de un sistema digital de análisis de imágenes histopatológicas. En este tercer ensayo se utilizaron técnicas computarizadas de análisis digital de imágenes histopatológicas (técnicas de interpretación histológica basadas en el análisis de imágenes, cuantificación molecular de marcadores mixtos en estudios colorimétricos) enfocado en la detección y conteo de los infiltrados linfocitarios, conteo de cardiomiocitos y la determinación de hipertrofia cardiaca en ratones infectados con cepa Sylvio X10/4 de T. cruzi y la comparación de los resultados obtenidos con los resultados histológicos basados en observación y análisis visual realizado con tres patólogos en un ensayo doble ciego. Se usaron ratones BALB/c (n=48), los cuales fueron vacunados con TcVac1 vía intradérmica con electroporación, los ratones fueron sacrificados al día 60 post-infección y el análisis histopatológico se llevó a cabo como sigue; A) Se examinaron al menos cinco secciones por tejido (ventrículo derecho, ventrículo izquierdo y septum) para cada ratón para detectar la presencia de inflamación aguda y nidos de parásitos (magnificación: 400X y 100X), el parasitismo tisular se evaluó contando los nidos de amastigotes presentes en 100 campos microscópicos en cada uno de los corazones analizados. Del mismo modo, el V infiltrado inflamatorio se visualizó en >200 campos microscópicos de las secciones de tejido del corazón, tres patólogos analizaron en un estudio doble ciego las muestras, y se registraron los resultados finales del consenso. B) los tejidos fueron procesados en cortes 4 μm, teñidos con HE y analizados en las mismas secciones mencionados anteriormente. Los tejidos fueron observados bajo microscopio óptico y se llevó a cabo el análisis colorimétrico a través del software Image-Pro Plus 5.1. para todas las muestras. Finalmente, la comparación de los datos obtenidos de ambas técnicas fueron comparados. Los resultados mostraron la eficacia del análisis computarizado y la precisión de los datos obtenidos, donde había una diferencia estadísticamente significativa (P˂0.05) entre los grupos vacunados y no vacunados. la conclusión del presente experimento fue la obtención de datos cuantitativos para los estudios histopatológicos sin la necesidad de usar otras técnicas más costosas como inmunohistoquímica, FISH, ISH (silver-based), immunocitoquìmica, expresión de proteínas marcadas, etc. y evadir el margen de error humano en la recopilación y procesamiento de datos.